Ultracentrífuga

La ultracentrífuga es una centrífuga optimizada para altas velocidades . Las ultracentrífugas modernas (UZ) pueden alcanzar aceleraciones de hasta 10 ⁶ gy velocidades de hasta 150.000 revoluciones por minuto.

El UZ es un instrumento de laboratorio extremadamente importante y es imposible imaginar muchas áreas de investigación científica sin él. En biología celular , biología molecular y microbiología se utiliza para el fraccionamiento y purificación de componentes celulares, en nanotecnología para la purificación y separación de nanopartículas .

Se hace una distinción general entre dos tipos de ultracentrífugas, la preparativa y la analítica .

Las áreas de aplicación del preparativo UZ incluyen sobre todo la granulación y purificación de fracciones de partículas finas como orgánulos celulares , proteínas , virus, etc.

La ultracentrífuga analítica fue desarrollada por The Svedberg a mediados de la década de 1920 . Se utiliza principalmente para determinar coeficientes de sedimentación y pesos moleculares . Por tanto, proporciona información sobre la forma, los cambios conformacionales, las distribuciones de tamaño y las interacciones de las macromoléculas .

Estructura y principio de funcionamiento

El UZ separa las partículas disueltas mediante fuertes fuerzas centrífugas generadas en un rotor giratorio . El proceso de separación depende de las propiedades de sedimentación de las partículas (ver también velocidad de sedimentación ). Estos están determinados por varios factores, pero sobre todo por el tamaño, la densidad y la forma de las partículas. Durante el UZ, fuerzas centrífugas extremadamente altas actúan sobre las partículas. Por eso también se pueden separar partículas muy pequeñas. Las fuertes fuerzas centrífugas son posibles gracias a la estructura especial de la UZ. A diferencia de otras centrífugas, el rotor está ubicado en una cámara de vacío. Debido al vacío , el rotor ya no experimenta resistencia del aire mientras está funcionando y, por lo tanto, puede alcanzar aceleraciones y velocidades muy altas. El calor realmente generado por el movimiento del rotor se evita enfriando la cámara de vacío. La temperatura de la cámara de vacío se puede ajustar libremente y, por lo tanto, se adapta de manera óptima a la muestra, a menudo sensible.

Tanto en la UZ preparativa como en la analítica, se utilizan tipos de rotor especiales. El UZ analítico también está equipado con un sistema de medición óptica.

Ultracentrifugación preparativa

El UZ preparativo se utiliza para separar partículas en función de su tamaño ( granulación simple y diferencial , sedimentación zonal) o su densidad ( centrifugación en gradiente de densidad isopícnica ). Los UZ utilizados con fines preparativos logran las mayores aceleraciones y las velocidades más altas, hasta 10 ⁶ gy hasta 150.000 revoluciones por minuto (rpm).

En la UZ preparativa se utilizan dos tipos de dispositivos: las ultracentrífugas grandes de suelo (Fig. 1) y las ultracentrífugas de mesa (Fig. 2). Debido a sus rotores más pequeños, las ultracentrífugas de mesa alcanzan las velocidades más altas. Por eso se utilizan para purificar partículas particularmente pequeñas, como las subunidades ribosómicas. Sin embargo, cuando se trata de volúmenes de muestra más grandes, se utilizan ultracentrífugas (ultracentrífuga de mesa: hasta aprox. 195 ml; ultracentrífuga: hasta aprox. 560 ml). Estos logran aceleraciones de hasta 8 × 10 ⁵ gy velocidades de 100.000 rpm.

Un tipo especial de ultracentrífuga de sobremesa es el llamado airfuge. Su rotor es impulsado por aire comprimido y puede alcanzar velocidades de hasta 110.000 rpm en 30 segundos. Por lo tanto, el Airfuge se utiliza a menudo cuando es necesario un procesamiento particularmente rápido de las partículas de muestra, p. Ej. B. si la muestra es un complejo receptor- ligando inestable .

Rotores

Es crucial para el resultado exitoso de un experimento que todos los materiales utilizados en UZ se adapten de manera óptima entre sí y con los requisitos de la muestra. La elección del rotor es de vital importancia aquí. El mejor resultado posible se logra cuando el rotor limpia o concentra las partículas en la muestra con la máxima eficiencia. A menudo, solo su velocidad máxima se considera una medida de la eficiencia de un rotor. De hecho, su desempeño está determinado por varios factores. Tres factores clave son: 1) el ángulo en el que se orientan los tubos de muestra, 2) la distancia de separación y 3) el tiempo de separación. Una medida simple de la eficiencia general de un rotor que toma en cuenta todos estos factores es lo que se conoce como factor k. Esto resulta como sigue:

${\ Displaystyle k = {\ frac {2.53 \ times 10 ^ {5} \ times ln (r_ {max} / r_ {min})} {(rpm / 1000) ^ {2}}}}$

Cuanto menor sea el factor k, mayor será la eficiencia del rotor.

Hay tres tipos generales de rotores: rotores de ángulo fijo, rotores basculantes y rotores verticales (Fig. 3). La diferencia más notable entre ellos es el ángulo en el que los tubos de muestra se alinean con el eje de rotación del rotor mientras la centrífuga está funcionando y en reposo. Con rotores de ángulo fijo, los tubos de muestra están inclinados (entre 20 ° y 45 °), con rotores basculantes, las muestras son horizontales y con rotores verticales son verticales. El ángulo de orientación tiene una influencia decisiva en la creación de efectos de pared, que tienen un efecto disruptivo en la formación de bandas de partículas.

El ángulo de orientación también determina la distancia de separación. Esta es la distancia que las partículas de la muestra tienen que viajar en el tubo de muestra para sedimentar en la pared del tubo. La distancia de separación se puede calcular a partir de la diferencia entre r _max (la distancia entre el eje del rotor y la parte inferior del tubo) y r _min (la distancia entre el eje del rotor y el comienzo del tubo) (Fig.3). Las distancias de separación para los mismos rotores resultan del diámetro del tubo de muestra y del ángulo de orientación del tubo durante el funcionamiento de la centrífuga.

La velocidad máxima de un rotor y su _rmax determinan la fuerza máxima de aceleración del rotor. Otro parámetro importante es r _min , que determina la fuerza centrífuga sobre las partículas en la parte superior del tubo de muestra.

En la práctica, se utilizan tubos de ensayo especiales para reducir el factor k de un rotor y así aumentar su eficiencia. Estos tubos tienen un volumen menor, lo que reduce la distancia de separación. Están cerrados con un espaciador. Como resultado, _rmax permanece sin cambios y, por lo tanto, también la aceleración máxima del rotor.

Por tanto, la elección correcta del rotor depende de varios factores. Sin embargo, depende ante todo de la aplicación planificada, la naturaleza y el volumen de la muestra y el proceso de separación requerido. Los rotores de ángulo fijo se utilizan generalmente para una granulación eficaz y una centrifugación de densidad isopícnica de macromoléculas. Los rotores basculantes se utilizan principalmente para la centrifugación por densidad isopícnica de células y orgánulos celulares, así como para la sedimentación zonal. Los rotores verticales se utilizan principalmente en la centrifugación en gradiente de densidad sin formación de gránulos (Tabla 1).

Formas especiales de rotor

Además de los tres tipos de rotor mencionados anteriormente, también hay algunas formas especiales del rotor vertical. El rotor zonal y el rotor de flujo continuo son de particular importancia aquí (Fig. 4). Estos fueron desarrollados especialmente para grandes volúmenes de muestra. Se utilizan para separar partículas de muestra más grandes, como bacterias, células, orgánulos celulares o virus de los homogeneizados de tejidos, pero también son cada vez más importantes en la purificación de nanopartículas. Estos rotores tienen una aplicación importante en la fabricación comercial de vacunas.

La gran capacidad de estos rotores (de 50 a 100 veces mayor que la de un rotor basculante convencional) se logra prescindiendo del uso de recipientes de muestras individuales. En cambio, la muestra se coloca directamente en el espacio del rotor, en su mayoría cilíndrico. En los rotores zonales, se pueden separar grandes volúmenes de muestra mediante centrifugación en gradiente de densidad. Para hacer esto, el medio de gradiente se coloca directamente en el espacio del rotor y luego se cubre con la muestra. Los rotores de flujo continuo también están equipados con un sistema de bomba que permite que la solución de muestra fluya continuamente a través de la cámara del rotor durante el ciclo de centrifugación. Esto permite alcanzar un rendimiento de muestras de hasta nueve litros por hora. Por lo tanto, estos rotores son especialmente adecuados para la sedimentación o concentración de partículas de muestra grandes (> 50 S ) de soluciones de muestra muy líquidas. Mediante un proceso de carga y descarga especialmente adaptado, los rotores de flujo continuo también se pueden utilizar para la centrifugación en gradiente de densidad.

Una tercera forma especial son los rotores casi verticales, en los que los tubos de muestra sólo se giran ligeramente, entre 7,5 ° y 9 ° aproximadamente. La distancia de separación acortada resultante, a diferencia de los rotores verticales normales, reduce el tiempo de separación o centrifugación. La ligera inclinación evita que la solución y las bandas de gradiente que pueda contener entren en contacto con el sedimento al final del ciclo de centrifugación.

Granulación fácil

La granulación simple es una de las técnicas de centrifugación más simples y más utilizadas. Por lo general, se usa como parte de un proceso para recolectar células o para aislar material precipitado. La granulación (sedimentación) se refiere a la separación de material particulado y no particulado. El material particulado se acumula en el fondo del tubo de muestra durante el ciclo de centrifugación y forma un sedimento sólido allí después del tiempo de centrifugación correspondiente. La granulación simple generalmente representa un paso temprano en los procesos complejos y de múltiples etapas para la purificación de partículas. El sobrenadante o la granulación se desecha o se procesa posteriormente.

Durante la purificación de proteínas (artículo principal purificación de proteínas ), por ejemplo, la proteína a ser examinado es primero z. B. sobreexpresado en bacterias que se cultivan en una solución nutritiva. Se utiliza una centrífuga de gran volumen para "recolectar" las bacterias de la solución. Las bacterias forman un gránulo en el fondo del tubo. Después de descartar la solución nutritiva sobrenadante, el sedimento se procesa más. Cuando vesículas extracelulares (EVs), por ejemplo exosomas , se purificaron , sin embargo, el sedimento se desechó y los vehículos eléctricos se obtienen a partir del sobrenadante. En las siguientes etapas de purificación de ambos ejemplos, se suelen utilizar otros métodos de centrifugación, como la centrifugación en gradiente diferencial y de densidad.

Pelletización diferencial

En la granulación diferencial (también conocida como centrifugación diferencial ), se unen varias series de centrifugación individuales. Este método se utiliza a menudo para la separación de fracciones subcelulares (por ejemplo, orgánulos celulares, fraccionamiento de células del artículo principal ) . Primero, se homogeneiza un tejido o una suspensión bacteriana triturando o triturando, por ejemplo, utilizando una prensa francesa (artículo principal prensa francesa ), y luego se hace flotar con una solución tampón fisiológica. A continuación, este homogeneizado se somete a sucesivas etapas de centrifugación con aceleración creciente. Después de cada paso de centrifugación, el sobrenadante se separa cuidadosamente del sedimento y se somete a otro ciclo de centrifugación. Con una aceleración creciente, se pueden peletizar partículas cada vez más pequeñas. En el procedimiento que se lleva a cabo habitualmente para la purificación de orgánulos celulares, los núcleos celulares , así como partes de la membrana plasmática y células enteras no fragmentadas, estarían contenidas en el sedimento después del primer ciclo (10 min, aprox.600 g ). . Después de centrifugación adicional los pasos con el sobrenadante respectivo, el sedimento de la cuarta carrera (60 min, 10 ⁵ g ) que contienen los muy pequeños componentes, solubles del citoplasma , tales como enzimas , lípidos y sustancias de bajo peso molecular tales como sales y azúcares . Las fracciones de células obtenidas de esta manera contienen siempre varios tipos de partículas. Estos a menudo se purifican a partir de las fracciones de células individuales mediante centrifugación en gradiente de densidad posterior.

Centrifugación en gradiente de densidad

El gradiente de densidad se aplica, por ejemplo, para una mayor purificación y separación de las fracciones de partículas de la centrifugación diferencial. En contraste con este proceso, aquí se usa un solvente con un gradiente de densidad. Esto permite separar mejor las fracciones de macromoléculas. Se añade una sustancia (por ejemplo, sacarosa ) al disolvente , cuya concentración cambia en relación con la distancia al eje de rotación. Esto da como resultado una densidad variable dependiente de la ubicación en el tubo de muestra, un gradiente de densidad que actúa sobre las macromoléculas que se fraccionarán durante el ciclo de centrifugación. Esto crea bandas claramente separadas con fracciones de las partículas que se pueden utilizar para otros fines preparativos o analíticos. Los tipos más importantes de centrifugación en el gradiente de densidad son la sedimentación por zonas y la centrifugación isopícnica.

Sedimentación de la zona

La sedimentación de zonas se utiliza para separar partículas según su tamaño, por ejemplo, tipos de células, orgánulos celulares pero también proteínas. La formación de las bandas en este método depende de la duración del ciclo de centrifugación, que se interrumpe antes de que se establezca un estado de equilibrio entre el disolvente y las partículas de la muestra.

En el caso de sedimentación por zonas, el gradiente se cubre con la muestra a separar. La densidad de la suspensión de la muestra es menor que la del gradiente, por lo que bandas (zonas) de diferentes partículas migran con una separación relativamente buena durante la centrifugación posterior. Después de un tiempo de sedimentación adecuado, las bandas se pueden recolectar, p. Ej. B. pipeteando el sobrenadante o retirando la banda por medio de una cánula. Los gradientes planos se utilizan principalmente para la sedimentación de zonas; es decir, solo hay una ligera diferencia de densidad entre la parte superior e inferior del tubo.

El gradiente de densidad es importante para formar o mantener las bandas por las siguientes razones. La aceleración centrífuga aumenta proporcionalmente con la distancia al eje de rotación. Es decir, la velocidad de sedimentación que actúa sobre las partículas aumenta hacia el fondo del tubo de centrifugación. Sin gradientes, esto conduce a que las bandas de partículas diverjan y se superpongan. El gradiente contrarresta el aumento de la velocidad de sedimentación de dos formas. Primero, la densidad y por lo tanto la viscosidad del gradiente también aumenta con la distancia desde el eje de rotación. El aumento resultante del coeficiente de fricción contrarresta la velocidad de sedimentación de las partículas. En segundo lugar, al aumentar la densidad en el gradiente, también aumenta la flotabilidad que actúa sobre las partículas, lo que también contrarresta el aumento de la velocidad de sedimentación.

Para este tipo de centrifugación se suelen utilizar rotores basculantes o rotores verticales (Fig. 3). Los rotores de ángulo fijo son menos adecuados porque, debido a la colisión de las macromoléculas con la pared del tubo de centrífuga, es difícil que se desarrollen bandas que migren sin perturbaciones.

Un ejemplo de aplicación típico es la separación de subunidades ribosómicas en un gradiente de densidad de sacarosa. Para la separación de diferentes tipos de células, p. Ej. B. Los linfocitos u orgánulos celulares se utilizan principalmente en gradientes de Ficoll o Percoll.

Centrifugación isopícnica

En la centrifugación isopícnica, la separación de partículas se basa en su densidad. Se centrifuga hasta que se establece un equilibrio de sedimentación para que las partículas se separen. Los tipos de partículas han formado bandas en posiciones en el gradiente que corresponden a su densidad de flotación. Las partículas no migrarían más en el medio incluso con tiempos de centrifugación más largos.

Los gradientes autoformados y preformados se utilizan para la separación isopícnica de macromoléculas. Los gradientes para partículas más grandes como células u orgánulos suelen estar preformados, lo que significa que ya están en equilibrio de sedimentación. Este método se puede utilizar, por ejemplo, para separar partículas en un homogeneizado. Un gradiente de densidad principalmente lineal , p. Ej. B. Se administra una solución de sacarosa y se cubre con la solución de muestra.

Los gradientes de formación automática se utilizan generalmente para separar macromoléculas y otras partículas pequeñas. El gradiente está aquí durante el funcionamiento de la centrifugadora con el inicio de la sedimentación del medio de gradiente, z. B. Se formó una solución salina concentrada. Este tipo de centrifugación isopícnica se utiliza, por ejemplo, para purificar el ADN . Proporciona ADN plasmídico de alta pureza . En el gradiente de cloruro de cesio , los ácidos nucleicos se separan en función de su densidad. En presencia de bromuro de etidio, el ADN cromosómico se puede separar del ADN plasmídico. El bromuro de etidio se intercala entre las hebras de ADN, pero se adhiere con mucha más fuerza al ADN plasmídico. Esto le da una densidad más alta y forma una banda que está más alejada del eje de rotación que la del ADN cromosómico.

En la centrifugación isopícnica, el medio del gradiente se superpone con la muestra, se mezcla o la muestra se introduce en el fondo del gradiente (separación por flotación). El último método se utiliza para la separación de diferentes tipos de lipoproteínas , así como para el subfraccionamiento de diferentes tipos de membranas.

La elección del rotor depende del tipo de muestra. Para partículas más grandes, los mejores resultados se obtienen con rotores de cubeta basculante. Los rotores de ángulo fijo son especialmente adecuados para separar macromoléculas porque logran la mejor resolución.

Tabla 1: Tipos de rotor y su aplicación

Partícula	solvente	Procedimiento	Tipo de rotor
ADN, ARN, proteínas, macromoléculas	Sales (CsCl, Cs 2 SO 4 , KI, ..)	centrifugación isopícnica	Rotores de ángulo fijo
Organelos, membranas	Sacarosa, Optiprep, Nycodenz	centrifugación isopícnica	Rotores basculantes
Separación de tipo de celda	Tampón osmótico Percoll +, Nycodenz, Optiprep	Sedimentación zonal	Rotores basculantes, rotores verticales

Ultracentrifugación analítica

Con la ultracentrifugación analítica , el movimiento de los analitos en el campo gravitacional se registra espectroscópicamente en línea . Debe hacerse una distinción entre dos experimentos básicos. La corrida de sedimentación proporciona el coeficiente de sedimentación . En la ejecución de equilibrio hay un equilibrio de concentración estático, como en el equilibrio hidrostático , a partir del cual se puede determinar la masa molar de la macromolécula con alta precisión, p. Ej. B. por centrifugación en gradiente de densidad .

Ejemplos de uso en bioquímica

• para el aislamiento de lipoproteínas (ultracentrifugación en gradiente de densidad)
• para concentrar proteínas con una masa molar elevada , como los microsomas (ultracentrifugación diferencial)
• como paso de limpieza para el aislamiento de virus y partículas similares a virus que son necesarios para la investigación o como materiales de partida ( antígenos ) para la producción de pruebas de diagnóstico (ultracentrifugación en gradiente de densidad)
• Determinación de coeficientes de sedimentación y pesos moleculares de macromoléculas.

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