Clonación

La clonación (o clonación , clonación molecular inglesa ) es el término genérico en biología molecular para los métodos de obtención y duplicación idéntica de ácido desoxirribonucleico (ADN). A diferencia de la clonación , cuyo objetivo es producir organismos genéticamente idénticos, la clonación se limita a producir moléculas idénticas de ADN.

propiedades

Durante la clonación, un fragmento de ADN deseado (por ejemplo, un gen o el ADNc que codifica una proteína ) se integra en un vector (por ejemplo, un plásmido o un vector viral ). El objetivo de la clonación es multiplicar un fragmento de ADN para investigar sus propiedades o utilizarlo en otros procesos. Tras la replicación, el aislamiento del ADN plasmídico permite obtener un múltiplo de la cantidad de ADN inicialmente utilizada, que, a diferencia de los métodos in vitro como la PCR, es económico, preciso y se realiza en grandes cantidades. Alternativamente, las células pueden ser un producto génico , como la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, en una sobreexpresión de proteínas). La clonación juega un papel

Se utilizan varios organismos como huéspedes para la replicación de los productos de clonación . Ejemplos bien conocidos son células bacterianas como la bacteria Escherichia coli , algas unicelulares u hongos. Las células huésped se multiplican por división celular , produciéndose copias idénticas del ADN diana que se va a clonar. El resultado es una población de células que contienen un clon del fragmento de ADN deseado. Se aísla un clon adecuado de esta población para su uso posterior.

El ADN clonado se puede utilizar para transferir uno o más genes a organismos extraños con el fin de mejorar los procesos metabólicos o conferir resistencia (manipulación genética en animales y plantas). Mediante una clonación funcional se identifican secuencias de ADN similares mediante una clonación posicional se identifican secuencias de ADN adyacentes.

procedimiento

Durante la clonación se utilizan los denominados vectores ("transbordadores de genes"). Estos sirven como medio de transporte para la transferencia de una determinada secuencia de ADN (llamada transgén o inserto ) a una célula receptora y su replicación. Existen varios métodos para hacer que estos vectores sean receptivos al ADN extraño:

Restricción y ligadura

Representación esquemática de una clonación con restricción y ligadura.

En el plásmido, la clonación de un plásmido (por ejemplo, pUC19 ) en el transcurso de una digestión de restricción usando enzimas de restricción específicas cortan el desplazamiento de modo que se produzcan los extremos que sobresalen (engl. Extremos pegajosos , extremos pegajosos). El ADN que se insertará es un fragmento que se aisló de otro vector utilizando las mismas enzimas, ADN sintético con los voladizos correspondientes o ADN amplificado a partir de ADN genómico o ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Antes de que los productos de la PCR se inserten en el vector, se cortan con las mismas enzimas para que se creen extremos complementarios en el vector y el ADN diana. Los extremos sobresalientes mutuamente compatibles del vector y el ADN diana se encuentran y se hibridan entre sí. En la ligación posterior , que es catalizada por una ADN ligasa (por ejemplo, ADN ligasa T4 ), los extremos de las hebras simples se unen covalentemente entre sí . Con el fin de reducir el fondo de los clones sin inserciones, el vector se usa a menudo para eliminar el grupo fosfato 5 'antes de la ligación con fosfatasa, p. Ej. B. Tratamiento con fosfatasa de intestino de ternera (CIP) . Esto también permite una clonación eficaz en vectores que solo se han tratado con una enzima de restricción.

Después de la transformación posterior, las bacterias recombinantes se seleccionan colocándolas en placas de agar con un antibiótico adecuado . Si los vectores lo permiten, las colonias que no contienen inserto se seleccionan mediante un tramado azul-blanco . Esto tampoco garantiza que todas las demás colonias contengan el inserto deseado. Por lo tanto, el ADN de colonias individuales se caracteriza por digestión de restricción o PCR de colonias . Si el resultado no es concluyente o el inserto se generó por amplificación de ADN , secuenciación de ADN se lleva a cabo . Si una de las enzimas utilizadas para cortar el vector deja un extremo romo , el fragmento de PCR se corta con una sola enzima.

Clonación por PCR

En esta variante, la secuencia de ADN a insertar se amplifica en una PCR utilizando cebadores, cada uno de los cuales contiene una secuencia en el extremo 5 'que se solapa con el vector. El producto de PCR purificado se encuentra en el curso de la ligación durante la amplificación (reacción de mutagénesis relacionada con la PCR ) como un megacebador que utilizó el plásmido in vitro para sintetizarlo. Aquí no se utilizan enzimas de restricción ni ADN ligasa. Una vez que los plásmidos iniciales se han descompuesto, los plásmidos recién generados se transforman en bacterias para la reproducción. La ligadura tiene lugar después de la transformación in vivo . Una variante de la clonación por PCR es la clonación por extensión de polimerasa circular (CPEC).

Clonación de TA

Los plásmidos TA también son plásmidos linealizados que, sin embargo, tienen un nucleótido de timidina como último nucleótido como un saliente 3 ', que actúa como un extremo pegajoso y elimina la necesidad de restringir el ADN y el plásmido a insertar. El nucleótido de timina que sobresale se une previamente mediante una desoxirribonucleotidil transferasa ( desoxinucleótido transferasa terminal en inglés ) usando nucleótidos de didesoxi timina . La secuencia de ADN a insertar debe generarse con una ADN polimerasa termoestable de tipo A (origen bacteriano), ya que las polimerasas de tipo B no crean un voladizo. Después de la ligación, el plásmido se transforma en bacterias para su propagación. La clonación de TA evita el uso de enzimas de restricción, pero no permite la orientación dirigida del inserto en el vector, como resultado de lo cual la expresión génica puede tener lugar solo en aproximadamente el 50% de los vectores transgénicos. Por lo tanto, los vectores TA se utilizan a menudo en combinación con un cribado azul-blanco como vectores de clonación puros .

Clonación de TOPO

Los plásmidos TOPO se linealizan mediante digestión de restricción y luego se acoplan covalentemente con una topoisomerasa del virus vaccinia (un virus de la viruela ), lo que provoca la ligadura de un producto de PCR y, por lo tanto, ya no requiere una ligasa. La topoisomerasa se une covalentemente a una secuencia de ADN en el extremo 3'-fosfato de la secuencia 5'- (C / T) CCTT-3 '. Los vectores de clonación TOPO están disponibles como vectores TA y como vectores de extremos romos . Luego, el plásmido se transforma en bacterias para su reproducción. Dado que la orientación del inserto en el vector es aleatoria, estos vectores se utilizan como vectores de clonación puros. Si el primer paso es generar un clon de expresión , se utilizan vectores TOPO unidireccionales . A menudo, los vectores de entrada unidireccionales también se utilizan para el sistema de puerta de enlace . TOPO y Gateway son marcas comerciales registradas de Thermo Fisher Scientific .

Montaje isotérmico

Mediante ensamblaje isotérmico, sea ​​mediante PCR o síntesis de genes artificiales, se producen fragmentos de ADN sin necesidad de ser tratados con estas enzimas de restricción previamente insertadas en un vector linealizado. A menudo se utiliza el ensamblaje Gibson , que fue desarrollado por Daniel G. Gibson en el Instituto J. Craig Venter . Permite la clonación perfecta de uno o más fragmentos en un vector en un solo paso . El requisito previo es que las moléculas a ligar tengan superposiciones de secuencia de aproximadamente 20 nucleótidos . Por incubación con dNTPs y un cóctel de tres enzimas, una exonucleasa ( T5 exonucleasa ), lo que acorta las moléculas desde el extremo 5' y por lo tanto permite que las moléculas a hibridan , una ADN polimerasa ( Phusion ADN polimerasa), los huecos resultantes están cerrados, y una termoestable ADN ligasa ( Taq ADN ligasa ), lo que provoca un cierre de anillo, crea plásmidos que se pueden transformar directamente. Gibson Assembly es una marca registrada de New England Biolabs .

LIC y SLIC

En una variante de clonación adicional ( clonación independiente de ligación , LIC), el producto de PCR se proporciona con una secuencia LIC. Mediante la actividad exonucleasa 3 '→ 5' de la ADN polimerasa de T4 , se generan proyecciones complementarias en el vector y en el producto de PCR en presencia de un dNTP . La ligación del producto recocido tiene lugar después de la transformación in vivo . Un desarrollo adicional del método es SLIC, la clonación independiente de la secuencia y la ligación que no requiere una secuencia LIC. La actividad de la exonuclasa se detiene en los protocolos SLIC agregando un dNTP. Los huecos en los plásmidos circulares formados después de mezclar los fragmentos de ADN se reparan después de la transformación en células de E. coli .

Clonación de puerta de enlace

En una clonación de entrada , se agregan secuencias al transgén que contienen secuencias de reconocimiento para la ligasa attB , que cataliza la incorporación del transgén en un vector de entrada . Al mismo tiempo, el gen suicida ccdB se elimina del vector de entrada , lo que significa que solo crecen organismos transgénicos con vectores. Un intercambio posterior de segmentos génicos con una escisionasa da como resultado una transferencia génica del vector de entrada a un vector diana, que principalmente sirve para expresar el transgén y tiene una resistencia a antibióticos diferente para la selección posterior . Como segunda presión de selección en este intercambio, el vector de entrada recibe el gen suicida ccdB del vector objetivo , lo que significa que casi solo crecen los organismos con el vector objetivo que contiene el transgén.

Clonación de Golden Gate

La clonación de la puerta de oro , también conocida como ensamblaje de la puerta de oro , permite el ensamblaje direccional in vitro simultáneo de varios fragmentos de ADN con la ayuda de las enzimas de restricción de tipo II y la ligasa de ADN T4 . Las enzimas de restricción de tipo II utilizadas en este método, como Bsa I, Bsm BI y Bbs I, cortan fuera de su secuencia de reconocimiento y, por lo tanto, pueden generar voladizos largos de cuatro pares de bases no palindrómicos que ya no tienen puntos de escisión después de la ligadura. Dado que los sitios de escisión de restricción no forman parte de la construcción resultante, la digestión de restricción y la ligación se pueden llevar a cabo simultáneamente. El método es i.a. utilizado para la producción de TALEN para la edición del genoma .

Recombinación

En el caso de procesos de recombinación como la recombinación y el proceso de intercambio de casetes RMCE , la restricción y la ligación tienen lugar después de que el vector y el inserto se hayan transformado in vivo .

Síntesis de genes artificiales

Usando varios métodos de síntesis de genes artificiales , los insertos se pueden sintetizar de novo a partir de cebadores. Las cadenas dobles sintetizadas ya contienen los extremos apropiados para la ligación en el vector deseado. Esto puede, por ejemplo, B. extremos que sobresalen para ligación en un vector de corte de enzima de restricción o superposiciones de secuencia para el ensamblaje de Gibson .

Transformación y Selección

Representación esquemática de la transformación de un ADN recombinante en una célula bacteriana y posterior selección de antibióticos.

A esto le sigue la transformación de células bacterianas competentes (por ejemplo, E. coli ) con la construcción de inserto de vector. El antibiótico - gen de resistencia en el vector permite la selección de células bacterianas que han tomado el plásmido en la célula. Con este fin, el método de transformación es en un agar - se sembraron en placa medio de cultivo (por ejemplo, medio LB ) del antibiótico apropiado (por ejemplo, ampicilina o kanamicina ) que contiene. De modo que solo se seleccionan las células bacterianas que han incorporado un plásmido. La multiplicación de estas células bacterianas individuales crea colonias bacterianas . Todas las bacterias no transformadas que no son resistentes al antibiótico utilizado mueren. Si los vectores tales. B. pUC19 lo permite, las colonias que no contienen un inserto se seleccionan mediante un examen azul-blanco . Para ello se utilizan placas que, además del antibiótico, también contienen X-Gal e IPTG . La aparición de colonias azules indica la presencia de células bacterianas con vectores inalterados, mientras que las colonias no teñidas pueden contener el inserto deseado. Por tanto, el ADN de colonias individuales se caracteriza directamente o después de la amplificación en cultivo líquido mediante digestión de restricción o PCR de colonias . Si el resultado no es concluyente o el inserto se generó por amplificación de ADN , secuenciación de ADN se lleva a cabo . Se inocula un medio líquido con dicha colonia para su posterior reproducción. Se puede aislar una gran cantidad de ADN plasmídico a partir de tal enfoque ( preparación de plásmido ). Entonces, el ADN está disponible para clonación o transformación adicional.

literatura

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